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[方法]A.PCR擴(kuò)增cDNA插入片段1．在冰浴中將以下成分加到0．2m1微量離心管中（執(zhí)行10步反應(yīng)）●水，36．5ul●10×Pfu緩沖液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制備好的Sfi-NotIλGTllcDNA文庫，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反應(yīng)物并用50ul的礦物油覆蓋。3．在95℃下使模板變性2分鐘，...
[方法]1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細(xì)胞。2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細(xì)胞3次。3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細(xì)胞，并加入7ml裂解緩沖液（可溶解達(dá)到5×108個(gè)外周血淋巴細(xì)胞），然后劇烈渦旋振蕩以溶解細(xì)胞。4．加入7體積（49m1）4m01/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時(shí)（過夜）。5．將懸液轉(zhuǎn)移到30mlCorex管內(nèi)，在吊桶式轉(zhuǎn)頭內(nèi)4℃離心2小時(shí)，6500r/min。6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰（大約15m...
[方法]1．為合成cDNA*鏈，在1個(gè)1．5ml硅化微量離心管中制備以下反應(yīng)混合液，●10－RT緩沖液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物濃度均為10pmol/ul2．取整數(shù)體積（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1個(gè)無菌1．5ml微量離心管內(nèi)，并用微型離心機(jī)離心5分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀1次，晾干，并用24．5ul...
[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的載體和scFv文庫●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制兩個(gè)100ul連接混合液，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫，另1個(gè)用于Vu-VλscFv文庫，并設(shè)置兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)。對(duì)照可以確定未切的載體有多少（對(duì)照2），以及確定無插入序列時(shí)有多少重新連接的載體（對(duì)照1）。要保持恰當(dāng)?shù)谋壤?，所獲得的克隆數(shù)（對(duì)于相...
[方法]1．將大腸桿菌TG1種到基本培養(yǎng)瓊脂板，37℃過夜。2．將基本培養(yǎng)瓊脂板上的大腸桿菌TGl再接種到含有15m12XTY培養(yǎng)基的100ml形瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)過夜。3．用5ml夜培養(yǎng)的TGl接種到兩個(gè)含500m12×Y培養(yǎng)基的2L有擋板錐形瓶中。在搖床中培養(yǎng)約1．5小時(shí)，直到A600接近0．5。4．將菌液轉(zhuǎn)移4個(gè)預(yù)冷離心瓶中（約250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分鐘。5．以3000g，4℃離心15分鐘。使用前預(yù)冷所有轉(zhuǎn)頭。6，棄去上清，并以起始體積的冰冷lmmol...
[器材和試劑]●用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號(hào)62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實(shí)驗(yàn)方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。2...
[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT緩沖液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應(yīng)加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內(nèi)，或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。3．用l根牙簽輕輕接觸單個(gè)克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動(dòng)，注意不要轉(zhuǎn)移太...
[器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設(shè)備●已擴(kuò)增的scFv基因文庫DNA[方法]1．配制4個(gè)50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...
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